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方法A:Linear poly(A) tailed RT-PCR,该方法由Fu等人(2005)首次公布,因其特点是采用poly(A)聚合酶处理RNA样本,将miRNA3’ 末端延长约11个碱基A,故命名时用“poly(A)-tailed”表示。其次是采用线性化的反转录引物进行反转录,该反转录引物末端含有11个碱基T3’ 端含有2个简并碱基,可与miRNApolyA)尾互补结合。因其反转录引物是线性化的,所以命名时用“Linear”表示。利用该通用型的反转录引物,理论上,可一次性将样品中所有表达的miRNA全部反转录成cDNA。最后是设计PCR扩增引物对,可利用TaqMan 探针或SYBR Green染料定量检测miRNA的表达。


方法B:Linear S-poly(A) tailed RT-PCR,该方法由Kang等人(2011)首次公布,因其特点与方法A类似,也是采用poly(A)聚合酶处理RNA样本,将miRNA3’ 末端延长约11个碱基A,故命名时也用“poly(A)-tailed”表示。尽管都是线性化的反转录引物,不同之处在于,其采用与miRNA3’ 5~8个碱基互补配对的特异反转录引物进行反转录,为了与方法A区别,所以命名时用“S”表示,此处的“S”是英文字母“Specific”的首字母。利用此反转录引物,每次仅能将单个目标miRNA反转录成cDNA。实验表明,该方法的灵敏度和特异性高于方法A。但是从经济成本角度讲却低于方法A。对于荧光定量PCR扩增,引物设计和实验流程与方法A一致。


方法C:Stem-loop RT-PCR,该方法由Chen等人(2005)首次公布,因其特点是采用与miRNA特异结合的茎-环反转录引物(stem-loopRT)进行反转录,因此命名时用“Stem-loop”标示。反转录引物特定区段设置的碱基序列自由能非常低,极易形成茎-环结构,主要目的除了延长miRNA外,还因为折叠后引物具有空间位阻,可很好地区分成熟体和miRNA前体,大大提高了miRNA定量表达检测的特异性。而茎-环反转录引物与目标miRNA结合,主要依靠其3’ 末端与miRNA3’ 末端5~8个碱基对的互补配对。与方法B类似,利用该特异的茎-环反转录引物,每次仅能将单个目标miRNA反转录成对应的cDNA。对于荧光定量PCR扩增,引物设计和实验流程与方法A一致。


方法D:Stem-loop poly(U) tailed RT-PCR,该方法由Mei等人(2012)首次公布,因其特点是采用poly(U)聚合酶处理RNA样本,将miRNA3’ 末端延长约11个碱基U,故命名时用“poly(U)-tailed”表示。其次是采用茎-环反转录引物(stem-loop RT)进行反转录,该反转录引物末端含有11个碱基A3’ 端含有2个简并碱基,可与miRNApolyU)尾互补结合,因此命名时用“Stem-loop”标示。与方法C类似,反转录引物特定区段设置的碱基序列自由能非常低,使其极易形成茎-环结构,目的除了延长miRNA外,还可区分成熟体和miRNA前体,以提高miRNA定量表达检测的特异性。与方法C不同的是,stem-loop反转录引物为通用序列,反转录时可将细胞或组织转录的所有miRNA反转录为cDNA。对于荧光定量PCR扩增,引物设计和实验流程与方法A一致。


方法E:Stem-loop poly(A) tailed RT-PCR,该方法为本公司首次公布,是在方法D的基础上改进而成。其特点是采用poly(A)聚合酶处理RNA样本,将miRNA3’ 末端延长约11个碱基A,故命名时用“poly(A)-tailed”表示。其次是采用茎-环反转录引物(stem-loop RT)进行反转录,该反转录引物末端含有11个碱基T3’ 端含有2个简并碱基,可与miRNApolyA)尾互补结合,因此命名时也用“Stem-loop”标示。其反转录引物为通用引物,一次反转录可将细胞或组织中所有miRNA反转录为cDNA。对于荧光定量PCR扩增,引物设计和实验流程与方法A一致。


方法F:Stem-loop S-poly(A) tailed RT-PCR,该方法为本公司首次公布,其特点与方法F类似,也是采用poly(A)聚合酶处理RNA样本,故命名时用“poly(A)-tailed”表示。其次是采用茎-环反转录引物(stem-loop RT)进行反转录,而茎-环反转录引物与目标miRNA结合,主要依靠其3’ 末端与miRNA3’ 末端5~8个碱基对的互补配对。为了与方法F区别,所以命名时用“S”表示,此处的“S”是英文字母“Specific”的首字母。其反转录过程与方法B类似,利用该特异的茎-环反转录引物,每次也是仅能将单个的目标miRNA反转录成cDNA。对于荧光定量PCR扩增,引物设计和实验流程与方法A一致。






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